１、选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。
２、涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。
３、脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。
１、取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用马克笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。
２、涂片
液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近５厘米左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径２毫米左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。
固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。
３、晾干：让涂片在空气中自然干燥。
４、固定：让菌膜朝上，通过火焰２－３次固定（以不烫手为宜）。
５、染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染１分钟。
６、水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。
７、媒染：滴加１滴碘液，染１分钟，水洗。
８、脱色：吸去残留水，连续滴加９５％乙醇脱色２０－３０秒至流出液无紫色，立即水洗。
９、复染：滴加蕃红复染３－５分钟，水洗。至此，革兰氏染色结束。
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